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    我好像發現:miRNA可以讓小RNA研究不一樣?!

    來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2021-4-2   訪問量:913評論(0)

    自1993年發現以來,miRNA被認定為轉錄后基因調節劑,通過與mRNA進行堿基配對從而抑制翻譯。


    但miRNA機制就如何簡單嗎?在同質化功能研究機制的今天,常規實驗很難發高分文章,有沒有新意點的機制助力高分文章呢?亦或者,高通量的結果顯示mRNA與miRNA存在正或負反饋調節活性,而傳統的3UTR預測兩者又無結合活性,是真的不結合嗎?


    實際上,miRNA的功能并非單一性結合編碼基因的3UTR行使翻譯抑制功能,miRNA功能具有多樣性,且不總定位于胞漿中。


    那么,miRNA能做出哪些花樣呢,且看小編羅列(案例只列舉miRNA機制的核心點,功能實驗本文省略,感興趣的老師可以到文末參考文獻處查看原文):


    (一)結合5UTR激活翻譯


    翻譯機制在哺乳動物細胞中受到嚴格調節,這部分是由核糖體蛋白(RP)的受控翻譯介導的。作者通過紫外光交聯法,發現與其直接互作的miR-10a,并預測了兩者結合位點是非常規的3UTR,而是5UTR。通過雙熒光素酶報告系統,構建核糖體RPS16蛋白的5UTR野生型,并與miR-10a的野生、突變共轉,發現mirRNA使蛋白的翻譯活性增強,而不是降低翻譯活性以及降解RNA。



    研究發現,乳腺癌,白血病等疾病都與mir-10增強核糖體蛋白的翻譯相關,這并非個例,如miR-122結合丙型肝炎病毒的5'UTR并調節病毒復制。


    (二)結合編碼區抑制翻譯


    Nanog、Oct4、Sox2是典型的維持干細胞狀態所需表達的轉錄因子,在視黃酸誘導的小鼠胚胎干細胞分化中上調的miR-134,miR-296和miR-470,以各種組合靶向每種轉錄因子的CDS,導致分化的小鼠胚胎干細胞具有轉錄和形態學變化特征,并產生新的表型。


    由于是編碼區,并不能像位于非翻譯區那樣構建雙熒光素酶報告系統,因此采取直接構建編碼區的過表達以及突變型(即miRNA結合處的同義突變,使得氨基酸相同,但是miRNA無法結合),并與miRNA前體過表達一起轉細胞,通過堿性磷酸酶對轉染三天后E14 ESC染色并進行WB,發現miRNA下調了蛋白表達并下調了幾種標志物的表達,突變型則逆反了上述結果:


    此研究推翻了翻譯抑制結合編碼基因3UTR的情況,對于前期研究有抑制,但預測3UTR無結合的,可以試試編碼區有無結合。


    (三)結合3UTR激活翻譯


    盡管大多數研究都集中在miRNA如何抑制基因表達,但一些研究也報道了miRNA上調基因表達。在血清饑餓的細胞中,AGO2和與miRNA-蛋白質復合物(microRNPs)相關的另一種蛋白質,脆性x智力障礙相關蛋白質1(FXR1)與3UTR處的富AU元件(AREs)相關,以激活翻譯。


    通過構建雙熒光素酶報告系統,將3UTR野生型,ARE序列,ARE突變型構建至報告系統,確認了ARE對于翻譯促進的作用


    包括let-7在內的幾種miRNA可在細胞周期停滯期間激活翻譯, miR16介導翻譯激活對于維持非洲爪蟾未成熟卵母細胞的未成熟狀態有重要作用。目前發現的3UTR翻譯激活多與miRNA-AGO-FXR1三聯復合物相關。


    (四)結合啟動子調控轉錄


    眾所周知,特定組織和細胞類型中基因表達的精確調節與增強子密不可分。因此,增強子能夠使其基因組功能準確確定每個基因在何時,何地以及以什么水平表達以適應特定的生理,病理或環境條件。常被認為細胞質中發揮功能的miRNA,經過深度測序,發現也大量存在于核內,這是怎么回事呢?


    作者首先觀察到miR-24-1與其鄰近基因FBP1和FANCC的蛋白表達水平呈現正相關(可以排除3UTR結合的翻譯抑制機制),Northern印跡顯示在miR-24過表達的細胞中,在細胞質和細胞核中檢測到成熟的miR-24,通過堿基互補配對,發現其可以結合基因組序列。針對結合處進行基因組缺失,以及對miRNA設計兩種突變,發現三者均失去對基因的激活效應:


    實際上, AGO2通過Importin-8或Exportin-1,并與TNRC6A互作,實現miRNA在核和細胞質之間穿梭。上述miR-24通過對增強子區域的H3K27ac(促進轉錄的組蛋白標記)增加,H3K9me3(抑制轉錄的組蛋白標記)的損耗達到上調基因的目的;類似的機制還有:

    (1)miR-522與CYP2E1啟動子內的DNA十字形結構(有義和反義DNA鏈上的莖環)相互作用,并抑制其轉錄;

    (2)let-7f以依賴于AGO2的方式與在兩個E2F靶基因CDCA8和CDC2的啟動子中發現的MRE結合;

    (3)miR-223也靶向NF1A啟動子,募集了多梳抑制復合物,并增加了DNA甲基化和抑制組蛋白標志物;


    由此可見,miRNA定位細胞核的機制具有多樣性。實際上,很多疾病的發生及進展與核miRNA功能相關,以腫瘤為例,當前報道的就有十幾例,可見,miRNA在核內發揮功能具有廣泛性:


    總 結


    本文搜羅了“不走尋常路”的miRNA,非編碼RNA從最初的轉錄垃圾,到今天研究的如火如荼,對于miRNA的研究可能具有指導意義,即今天我們認為的miRNA翻譯抑制功能實際上只是其功能的冰山一角?赡茉诟嗟臋C制或者疾病上,miRNA扮演了更加廣泛的角色,還有待我們發掘。

    本文列舉了當前發現的miRNA調控新機制,通過雙熒光素酶,構建miRNA或者基因的上下調,FISH等實驗,確認miRNA的功能模型。
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    參考文獻

    1.MicroRNA-10a Binds the 5′UTR of Ribosomal Protein mRNAs and Enhances Their Translation

    2.MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation

    3.AU-Rich-Element-Mediated Upregulation of Translation by FXR1 and Argonaute 2

    4.MicroRNAs activate gene transcription epigenetically as an enhancer trigger

    5.Nuclear functions of mammalian MicroRNAs in gene regulation, immunity and cancer

    6.Overview of MicroRNA Biogenesis, Mechanisms of Actions, and Circulation



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